Hội Nội tiết & Đái tháo đường Việt Nam Hội Nội tiết & Đái tháo đường Việt Nam
XÉT NGHIỆM PCR TRONG CHẨN ĐOÁN Y KHOA
TS. Trần Bá Thoại
Ủy viên BCH Hội NỘI TIẾT VIỆT NAM
I. LỜI MỞ
Đến nay, với các bệnh nhiễm trùng, ngành y vẫn áp dụng định đề Koch là phải chỉ ra vi sinh vật gây bệnh. PCR là xét nghiêm “định danh” ở mức gene phân tử có giá trị rất lớn giúp chẩn đoán khá nhiều căn bệnh khó trước đây.
II. PCR LÀ GÌ? LỊCH SỬ PHÁT MINH RA NÓ?
PCR (Chuỗi Phản ứng Polymerase, Polymerase Chain Reaction) là kỹ thuật phát hiện AND (hoặc ARN) của mầm bệnh hiện diện trong bệnh phẩm nhở vào phản ứng chuỗi enzyme polymerase khuếch đại lên cả triệu lần trong một thời gian ngắn. Nhờ PCR, từ một mẫu rất nhỏ AND (ARN), như từ một giọt máu, một sợi tóc hay chỉ một tế bào… phòng xét nghiệm có thể nhân lên, phóng đại ra hàng triệu bản cho các quá trình khảo sát, xác định tiếp theo.
PCR được phát minh bởi Kary Mullis, Công ty sinh học Cetus, Emeryville, California, Hoa Kỳ, năm 1983. Trên Scientific American, Mullis nhận định về kỹ thuật của mình: “Bắt đầu với một phân tử DNA di truyền, PCR có thể tạo ra 100 tỷ phân tử y hệt trong một buổi chiều. Phản ứng rất dễ thực hiện. Nó không cần nhiều hơn một ống nghiệm, một vài thuốc thử đơn giản và nguồn nhiệt”. Và với phát minh quan trọng này, Kary Mullis đã chia sẻ giải thưởng Nobel hóa học với Michael Smith năm 1993.
III. PCR VẬN HÀNH RA SAO?
Nguyên lý hoạt động của PCR là dùng enzyme trùng hợp polymerase để nhanh chóng tạo ra một lượng lớn các bản sao từ một đoạn DNA (ARN) chọn lọc.
Quy trình thực hiện PCR qua ba bước chính: biến tính; kết hợp; và mở rộng, lặp lại từ 30-40 chu kỳ. Chu trình được thực hiện trên một máy quay tự động, một thiết bị làm nóng nhanh và làm lạnh các ống nghiệm chứa hỗn hợp phản ứng.
* Biến tính (denaturation) thực hiện ở 94o C, giúp sợi xoắn kép DNA tách thành hai đoạn DNA chuỗi đơn.
* Ủ kết hợp (annealing) thực hiện ở 54o C, các cặp mồi kết hợp với “mẫu” chuỗi đơn, enzyme polymerase gắn vào và bắt đầu sao chép mẫu.
* Mở rộng (extension) thực hiện ở 72o C, polymerase tổng hợp các chuỗi DNA bổ sung cho mẫu được ghép với mồi, tạo ra một phân tử DNA sợi kép.
Các chu kỳ được đi lặp lại nhiều lần, nhiều bản sao được tạo ra và số lượng bản sao của mẫu được tăng theo cấp số nhân.
Đặc biệt, với các virus RNA, như HIV, sởi, quai bị, ZIKA… phòng xét nghiệm sẽ dùng enzyme sao chép ngược reverse trancriptase (RT) để biến đổi đoạn RNA của virus thành đoạn DNA bổ sung cDNA (complementory DNA) rồi tiến hành PCR, xét nghiệm này gọi là RT-PCR (Reverse Transcriptase-Polymerase Chain Reaction). Kỹ thuật này có hai giai đoạn:
* Tổng hợp cDNA bổ sung từ RNA bằng vào enzyme sao chép ngược (RT),
* Khuếch đại cDNA bổ sung này bằng PCR chính thống.
IV. NHỮNG ỨNG DỤNG CỦA PCR
Kỹ thuật PCR cho phép con người nhân lên cả triệu đoạn AND (ARN) trong thời gian rất ngắn. Vì thế, hiện nay PCR đã trở thành công cụ thiết yếu cho các nhà sinh học, phòng thí nghiệm pháp y, di truyền… ứng dụng để chẩn đoán bệnh di truyền, xác định vi khuẩn và virus, lấy dấu DNA vân tay, nghiên cứu sự tiến hóa của con người, nhân bản DNA của xác ướp, xác định quan hệ huyết thống hay sinh học.v.v…
Riêng trong lãnh vực y tế, PCR giúp chẩn đoán một số bệnh đặc hiệu, liên quan di truyền phân tử mà các phương pháp xét nghiệm truyền thống không thể làm được.Cụ thể xét nghiệm sinh học phân tử PCR và RT-PCR giúp chẩn đoán chính xác các bệnh như:
* Phát hiện các mầm bệnh không thể nuôi cấy thường quy được như các virus (viêm gan B, viêm gan C, Dengue, HIV, Herpes, CMV, EBV, HPV, virus SARS, H5N1…), các vi khuẩn (Chlamydia, Legionella, Mycoplasma, Treponema pallidum…).
* Phát hiện các vi khuẩn bệnh lây tình dục (sex transmitted diseases STDs (Chlamydia, Legionella, Mycoplasma, Treponema pallidum…).
* Phát hiện các tác nhân nuôi cấy thất bại vì ít có mặt trong bệnh phẩm, rất chậm phát triển, hay đã bị điều trị kháng sinh trước đó (lao thất bại nuôi cấy, viêm màng não mủ mất đầu…).
* Phát hiện nhanh các chủng virus Dengue của bệnh sốt xuất huyết.
* Phát hiện mầm mống của bệnh ung thư (HPV trong ung thư cổ tử cung, phát hiện gene APC trong ung thư đại tràng, gene BRCA1, BRCA2 trong ung thư vú, gene TPMT trong bệnh bạch cầu trẻ em, gen Rb-105 trong u nguyên bào lưới, gen NF-1,2 trong u xơ thần kinh, gen IgH và TCRy trong u lympho không Hodgkin…)
* Nghiên cứu về hệ kháng nguyên bạch cầu người (HLA, human lymphocyte antigen)…
* Phát hiện các chủng vi khuẩn kháng thuốc như S.aureus MRSA, các vi khuẩn sinh ESBL betalactamase, hay carbapenemase…)
* Xác định độc tố của vi sinh vật: Tiểu đơn vị A của độc tố ruột không chịu nhiệt của Escherichia coli.
* Trong công nghệ sinh học, xét nghiệm sinh học phân tử PCR được sử dụng trong việc lập bản đồ gen, phát hiện gene, dòng hoá gene, giải mã trình tự ADN…
V. ƯU, NHƯỢC ĐIỂM CỦA PCR
- ƯU ĐIỂM
Xét nghiệm PCR có nhiều ưu điểm vượt trội hơn hẳn so với xét nghiệm thông thường khác như: (1) Cho kết quả xét nghiệm nhanh, không quá 5 giờ kể từ khi bắt đầu làm xét nghiệm; (2) Độ đặc hiệu rất cao; (3) Phát hiện được nhiều tác nhân vi sinh vật gây bệnh mà phòng thí nghiệm hóa, sinh hay miễn dịch truyền thống không phát hiện được (4) Cho kết quả định lượng số copies virus, hỗ trợ bác sĩ điều trị đánh giá giai đoạn, hiệu quả điều trị, và tiên lượng bệnh; (5) Phát hiện các đột biến gene gây ung thư, và các bệnh di truyền khác…nhằm có biện pháp phòng ngừa bệnh.
- NHƯỢC ĐIỂM
Các nhược điểm của xét nghiệm PCR hiện tại: (1) Phải có labo hiện đại, chuẩn mực. Ngoài labo hiện đại, PCR cũng đòi hỏi kỹ thuật viên, bác sĩ phải có trình độ chuyên môn cao, (2) Giá thành xét nghiệm PCR còn khá cao; và (3) Vài trường hợp như đã dùng kháng sinh, lấy hay bảo quản bệnh phẩm sai quy cách có thể ức chế PCR khiến độ nhạy của xét nghiệm thấp.
VI. BÀN LUẬN
Trong y khoa, chẩn đoán xác định nguyên nhân gốc rễ (root cause) của căn bệnh là khâu đầu tiên và quan trọng nhất. Đặc biệt, trong các bệnh nhiễm trùng, cho đến nay ngành y vẫn áp dụng định đề Koch (Koch’s postulates) đưa ra từ năm 1884 “Tiêu chuẩn vàng để chẩn bệnh nhiễm là chỉ ra vi sinh vật gây bệnh”. Trong thực tế lâm sàng, rất khó đạt được nguyên tắc Koch này vì: (1) lượng vi sinh vật quá ít khó hoặc không phân lập đươc, (2) vi sinh vật nhân lên quá chậm, không kịp cho khâu điều trị đặc hiệu; (3) nhiều yếu tố tác động lên việc thu thập bệnh phẩm.
Theo lý thuyết, PCR là xét nghiệm “định danh” (identify) ở mức phân tử, bộ gene di truyền hiện đại, nên có độ đặc hiệu (specificity) rất cao, gần tuyệt đối đáp ứng “định đề Koch” để xác định bệnh. Với enzyme polymerase, một mẫu ADN (ARN) rất nhỏ, labo xét nghiệm dễ dàng nhân lên cả ngàn, triệu lần trong khoảng thời gian rất ngắn (khoảng 5 giờ), khiến việc nhận diện mầm bệnh quá dễ dàng, thuận lợi và điều trị kịp thời hơn. Do đó, hiện nay PCR được ứng dụng khá rộng rãi trong y khoa để xác định chẩn đoán.
Tuy có quá nhiều ưu điểm, nhưng cũng như các xét nghiệm chẩn đoán khác, PCR vẫn có nhược điểm “chết người” là độ nhạy (sensitivity, Se) trong một số bệnh phẩm còn thấp, nghĩa là cho “âm tính giả” còn cao. Điển hình là PCR trong bệnh viêm màng não lao (tuberculous meningitis), một bệnh đòi hỏi phải chẩn đoán và điều trị sớm để tiên lượng tốt và ít biến, di chứng. Dù PCR lao cho dịch não tủy có độ đặc hiệu Sp cao gần tuyệt đối 98%, nhưng độ nhạy Se lại rất thấp 56%. Vì thế, các bác sĩ lâm sàng thường phải: (1) Làm PCR lao thêm trên các mẫu khác, như máu, nước tiểu, đờm, dịch màng phổi, màng bụng; và (2) Làm thêm các xét nghiệm khác như IDR, soi đàm, chụp phổi…
VII. TÀI LIỆU THAM KHẢO
[1] PCR (Polymerase Chain Reaction)
https://www.medicinenet.com/pcr_polymerase_chain_reaction/article.htm
[2] PCR in diagnosis: Detection of bacteria in cerebrospinal fluids
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC119969/
[3] How does the PCR work ?
https://www.youtube.com/watch?v=3XPAp6dgl14
[4] Polymerase Chain Reaction (PCR)
https://www.youtube.com/watch?v=iQsu3Kz9NYo
[5] Basic Principles of RT-qPCR
[6] Reverse transcriptase polymerase chain reaction (RT-PCR)
[7] RT PCR (Reverse transcription PCR)
https://www.slideshare.net/iqrawazir7/rt-pcr-reverse-transcription-pcr
[8] Diagnostic accuracy of nucleic acid amplification tests for tuberculous meningitis: a systematic review and meta-analysis
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/14522262
[9] Nucleic acid amplification tests in the diagnosis of tuberculous pleuritis: a systematic review and meta-analysis
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC387423/
[10] Diagnosed tuberculous meningitis using cerebrospinal fluid polymerase chain reaction in patients hospitalized with the diagnosis of meningitis in referral hospitals in Isfahan
